Pan Lab at Southeast University

博士生孙梦实同学作为第一作者在Cell Reports杂志上发表研究论文“A neural pathway underlying hunger modulation of sexual receptivity in Drosophila females”，报道了雌蝇在饥饿状态下会更频繁的拒绝雄蝇求偶这一现象，并解释了调控这一行为的神经环路和分子机制。

本能行为是指不需要后天学习、训练即可产生的行为。但在复杂的自然环境中，往往会在同一时间产生不同的本能需求，比如进食与求偶。本课题研究雌性果蝇在饥饿状态下的生殖行为，即当内在需求产生冲突时生物体会如何做出行为抉择。研究发现，经历过食物剥夺处理的雌蝇相较饱腹雌蝇会更少接受雄蝇的求偶，并且饥饿雌蝇会在雄蝇进行求偶时更频繁的跳离以拒绝雄蝇的追求，这一过程通过AkhR/Tdc2神经元发挥调控功能。Akh（Adipokinetic hormone，脂动激素）是胰高血糖素在果蝇中的同源物，饥饿状态下由果蝇心侧体释放，和果蝇脂肪体细胞的AkhR受体结合后促进细胞脂质代谢，恢复下降的血糖。除了脂肪体，果蝇的神经系统中也有AkhR的表达。实验发现，饥饿激活果蝇脑中的AkhR神经元，AkhR神经元再通过释放章鱼胺抑制雌蝇的接受行为。有意思的是，饥饿状态下，AkhR/Tdc2神经元会有更多的神经元投射，表现出饥饿诱导的神经元形态的可塑性。同时，该研究也鉴定到了AkhR/Tdc2神经元的下游AV4c2神经元。章鱼胺通过与其受体OA2结合并激活AV4c2神经元，并由其释放抑制性神经递质伽马氨基丁酸（GABA）抑制雌蝇的接受行为。通过电镜数据库比较，作者发现AV4c2神经元和生殖行为的中枢神经元pC1存在突触连接，并利用钙成像实验证明饥饿和AV4c2神经元都能抑制pC1神经元的钙活性，行为学结果也证明pC1神经元失活后，因饥饿引起的雌蝇接受行为下降这一表型消失。该研究还证明饥饿是通过影响pC1神经元中乙酰胆碱（ACh）的功能来降低接受行为。pC1神经元在之前的研究中已被证明是调控接受行为的一类中枢神经元，且能够整合嗅觉信息（比如信息素）、听觉信息（比如求偶歌）以及雌蝇的交配经验（是否已交配过）。该研究证实pC1神经元也能够整合雌蝇的内在营养状态从而调控其生殖行为。

纪小小博士作为第一作者在EMBO reports杂志上发表研究论文“Asexuality in Drosophila juvenile males is organizational and independent of juvenile hormone”，报道了年幼雄蝇不表现出性行为是由于性环路组织重构不完全而并非依赖保幼激素的调控。

新生动物性能力的形成一般需要一定的性成熟时间而并不是与生俱来的，性行为的产生与神经环路的组织重构和生殖竞争中的适应性优化有关。性能力的获得一直有两种假说：一种是性成熟过程涉及组织结构上的神经环路的发育（组织性假说）；另一种是对已形成的神经环路功能性的激活或抑制的解除（激活性假说）。关于哺乳动物的研究大都支持组织性假说，而最近对于果蝇的一项研究认为性环路在年幼雄蝇中已经发育完全，但保幼激素暂时抑制了性环路的功能从而导致年幼果蝇不表现出性行为（图1左）。

图1：果蝇性成熟的两种假说

我们及其他实验室的以往研究发现，fruitless (fru)基因编码的雄性特异的蛋白Fru^M很大程度上决定了雄性果蝇求偶行为的产生，而表达Fru^M的神经元基本上组成了完整的求偶环路。研究发现，激活成年雄蝇的全部fru^M神经元可以在没有求偶目标的条件下稳定的诱导出雄蝇所有的求偶行为，而激活年幼雄蝇中所有fru^M神经元却并不能诱导出求偶行为。在年幼果蝇中激活一些已知的求偶促进神经元，只能够诱导出对潜在目标的低水平求偶，并且仅限于追逐目标等早期求偶步骤。本研究进一步发现了性成熟过程中雄性求偶神经环路的组织功能变化，即在羽化几天后突触连接以及传输会显著增加。研究还进一步发现，保幼激素并没有参与抑制年幼雄蝇性行为，反而具有促进求偶的功能。

本研究表明，年幼雄蝇不具备性能力是由于性环路在组织与功能上都还未发育完全，而不是由于保幼激素暂时的抑制造成的，揭示了昆虫与高等动物类似，都需要通过组织性的神经环路重构这一进化上保守的过程来获取性能力（图1右）。

行为的两性差异是基因决定的吗？对于人类或者其他高级生物来说，找到决定某些行为的两性差异的单基因可能很难，但在模式生物果蝇中却是可能的。比如，fruitless (fru)基因编码了雄性特异的蛋白Fru^M,很大程度上决定了雄性果蝇求偶行为的产生。但是，Fru^M蛋白仅在部分昆虫中存在，并未在高等动物中发现。是否存在更为保守的遗传机制决定了两性行为的差异？

doublesex (dsx)是一个高度保守的性别调控基因，其与同源的Dmrt基因均编码包含保守的DNA结合域的转录因子，决定了几乎所有已有研究物种的性别分化。在昆虫中，dsx基因在两性中编码性别特异的蛋白（雄性中为Dsx^M，雌性中为Dsx^F），直接决定了性别的分化。在一个性别中表达另一个性别的Dsx蛋白可以使果蝇变性。在哺乳动物中，Dmrt1决定了性腺的性别分化，进而通过性腺表达性别特异的性激素调控两性分化。这样一个高度保守的基因是否也在神经系统中发挥功能调控行为的两性差异呢？

2022年9月6日，实验室在PNAS杂志上发表研究论文“The doublesex gene regulates dimorphic sexual and aggressive behaviors in Drosophila”，揭示了dsx基因如何控制果蝇的本能性行为与攻击行为的两性差异。

针对性行为的两性差异，即雄性主动表演求偶仪式，雌性评估求偶质量之后决定接受或是拒绝雄性，该研究发现，两种截然不同的性行为均由表达在果蝇脑中的几百个Dsx神经元控制（大部分也表达Fru^M），Dsx^M在雄蝇脑中促进其发挥求偶行为的功能，而Dsx^F主要通过介导部分求偶神经元的凋亡进而抑制雄性行为在雌性中的产生。Dsx^F是否直接促进雌性接受行为还不清楚。

针对攻击行为的两性差异，即雄性的攻击性较雌性强，该研究发现，Dsx^M和Dsx^F分别促进了8-10对雄性特异的P1^a神经元和2对雌性特异的pC1d神经元的发育，搭建了两性攻击行为的神经环路基础；出乎意料的是，在成蝇阶段，Dsx^M促进了P1^a神经元发挥调控攻击的的生理功能，而Dsx^F抑制了pC1d神经元发挥调控攻击的的生理功能，从而使得雄性更为好斗（图1）。实验中，Dsx^F敲低的雌性会“痛打”Dsx^M敲低的雄性果蝇。

图1：雄性特异的Dsx^M和雌性特异Dsx^F蛋白的表达及其对两性不同攻击行为的调控。

这些发现不仅揭示了一个单基因如何调控果蝇性行为和攻击行为的两性差异，深化了对本能行为两性差异的分子与神经环路机制的理解；同时也提示高度保守的Dmrt蛋白可能在两个层次上调控动物行为的两性差异：（1）在发育过程中直接或间接地调控了性别特异的神经环路的发育，构建了两性行为差异的结构基础；（2）在行为过程中调控了其表达的神经环路的生理功能，进而调节相应行为的输出强弱。这些发现也进一步深化了对于人类行为调控的organizational-activational hypothesis理解。

本能行为是与生俱来而无需后天学习的，对动物的生存与繁殖来说至关重要。单一本能行为，比如性、打斗、觅食和睡眠等，在果蝇和小鼠模型中均已取得了很多进展；但是，不同本能行为之间如何抉择，比如选择求偶而放弃睡眠或觅食，在神经机制上还知之甚少。有机体如何整合外界环境、内在生理状态以及过去的经验，在一系列复杂的价值比较后选择性输出某个特定的本能行为，是神经科学的一个根本问题。

图1 行为抉择的计算模型示意图。(A-D) 从感觉神经元(S)到决策神经元(D)的线索积累通路（evidence-accumulating pathways）模型。S_A和S_B是接收外界信息的感觉神经元，D_A和D_B是整合线索的决策神经元。(A) 独立竞争模型。(B) 前馈抑制模型。(C) 决策神经元之间相互抑制的分布式模型。(D) 具有与其他决策神经元交互的公共神经节点的中央选择模型。黑色箭头表示兴奋，红线表示抑制。(E) Tinbergen 的等级模型。大脑中存在更高等级的决策中心，内外刺激共同作用于此。繁殖（repro）和觅食等主要的本能行为由不同的主要决策中心控制，高层级中心自上而下地调控低层级中心，每个层级的中心之间可能相互抑制。(F) Lorenz 的水力模型。内在状态就像流入水库的水提供压力（动力），而外界刺激的存在作为水阀释放压力并诱发某个行为。

本文首先总结了几类代表性的行为抉择模型（图1），包括诺贝尔奖获得者、神经行为学家Tinbergen和Lorenz分别提出的等级模型和水力模型；但是，这些模型都只能解释某些行为抉择过程中的特定现象，同时缺乏神经环路水平的直接证据。接着，本文以果蝇的性、打斗、觅食和睡眠这四种本能行为为例，总结了性相关行为与其他本能行为之间相互作用的神经环路机制，提出感觉信息的整合中心pC1神经元在本能行为抉择中可作为Tinbergen等级模型的“生殖中心”，并通过特定的方式与觅食和睡眠行为模块中的关键神经节点相互作用，以调控本能行为抉择（图2）。值得注意的是，pC1神经元具有较大的两性差异，其对性、打斗、觅食和睡眠行为的调控可能是本能行为及其选择性输出的两性差异的关键。在此基础上，本文提出了一个基于Tinbergen等级模型和Lorenz水力模型的混合模型，并在神经环路水平上解释了感觉信息如何整合并调控内在状态的“强度”和“持续性”，以及外界刺激如何在不同内在状态下诱发特定本能行为，从而产生行为抉择。

本文最后讨论了果蝇和小鼠模型中调控本能行为抉择的神经环路的相似性（图2），以及神经调质在行为选择或者转换过程中的重要作用。论文提出调控本能行为及其抉择的分子和神经环路在进化上具备一定保守性，各层次动物模型的研究将为理解高等动物包括人类的本能行为抉择提供一些共通的基本原理。

图2 雄性果蝇和小鼠中行为抉择的神经环路机制对比。果蝇中的pC1神经元和小鼠中的 VMHvl神经元都可以通过整合与性相关的感觉刺激和社交经验来编码生殖驱动。它们表达特定的性别调控因子，并且包括功能不同但关系密切的亚群，可直接调控性行为和打斗行为。它们还可以与其他本能行为的决策神经元交流，采用前馈或相互抑制等方式在生殖行为和其他竞争行为之间做出选择。pC1-a、pC1-b、VMHvl-a、VMHvl-b分别指代pC1和VMHvl神经元群体中不同的子集。黑色箭头表示兴奋，红线表示抑制，虚线表示尚不确定的连接。

动物行为是一个系统而复杂的机体活动，不但与遗传和环境因素有关，也深受肠道的共生微生物的影响。共生微生物不仅影响了宿主的代谢和免疫活动，还深刻地影响着宿主的行为，包括焦虑、认知和社会活动等。攻击行为是动物个体之间为争夺资源而发生打斗的一种高级社会行为，广泛地存在于各类动物中，包括模式动物果蝇。攻击行为使得优胜者获得控制重要资源的权利，包括食物、领域和配偶等，而失败者则丧失公平分享资源的机会，即“胜者为王，败者为寇”。研究模式动物的攻击行为有助于理解这一高级社会行为产生以及调控的机理。目前，在模式动物小鼠和果蝇中，调控攻击行为的神经环路机制已经得到较为深刻的研究，但是共生微生物是否影响以及如何影响宿主的攻击行为仍然未知。

本实验室联合培养博士生贾艺聪等人近日在Nature Communications上发表题为Gut Microbiome Modulates Drosophila Aggression through Octopamine Signaling的研究论文, 报道了共生微生物调控果蝇攻击行为的机制。

研究发现，相比于常规饲养果蝇，无菌果蝇的多种本能行为包括运动能力、睡眠、求偶行为并无异常，然而，无菌果蝇的攻击行为显著减少，这包括打斗频率的降低和打斗潜伏期的延长。研究进一步发现，在果蝇饲养食物中补充特定的细菌，可以有效地挽回经过经过无菌处理的果蝇的攻击行为。有趣的是，共生微生物促进宿主果蝇的攻击行为还需要保证充足的食物营养；在营养匮乏的情况下，共生微生物并不能促进宿主果蝇的攻击行为。同时，共生微生物与食物营养对果蝇攻击行为的促进存在一个关键发育期，即在果蝇幼虫取食的主要阶段（二龄和三龄幼虫）。这些研究结果揭示了发育早期的营养信号以及共生微生物协同促进了成年果蝇的攻击行为。

章鱼胺（Octopamine）是一类已报道促进果蝇攻击行为的神经递质。研究发现，共生微生物与食物营养协同促进了三龄幼虫以及成蝇脑内章鱼胺的表达水平，进而促进了成年果蝇的攻击行为。值得一提的是，尽管无菌果蝇的求偶行为正常，当一只无菌雄性果蝇与正常饲养的雄性果蝇竞争性向雌蝇求偶时，无菌果蝇的交配成功率显著降低。由于果蝇长期以腐烂的水果（存在大量微生物）为食，幼虫也生长在这些食物上，其交配行为往往也是聚集在食物上，该研究针对食物营养与微生物在发育阶段协同促进神经递质章鱼胺的表达，以促进攻击行为而增强繁殖优势的发现，也在进化上深化了对于共生微生物介导宿主攻击行为的理解。

本能行为是人与动物都具备的与生俱来的行为，不需要经过学习获得，比如吃、睡、逃避天敌等，通常都是生存与繁衍必要的行为，重要性不言而喻。本能行为主要由遗传控制，是研究基因如何决定行为的重要研究模型。

是否存在决定复杂本能行为的单基因？这一看似荒诞的问题，科学界其实已经争论了几十年。2001年斯坦福大学的Bruce Baker教授就在Cell上撰写综述探讨了这一问题，提出自然界确实存在决定复杂本能行为的单基因（尽管并不普遍），比如fruitless（fru）基因决定果蝇的本能求偶行为。果蝇的本能求偶行为仅存在于一个性别中，即雄性求偶，雌性不求偶；而fru基因正好产生雄性特异的蛋白Fru^M,缺失Fru^M的雄蝇不会对雌蝇求偶，而当在雌蝇中改造fru基因使其表达Fru^M蛋白时，雌蝇也开始表现求偶行为。一个基因，仅在一个性别中表达，开启性别特异的求偶行为；如果在本没有该行为的另一性别中表达，也能开启这一行为，似乎完美。那么，这个单基因是如何决定一套复杂本能行为的呢？

本实验室博士生陈洁等人近日在eLife上发表研究论文“fruitless tunes functional flexibility of courtship circuitry during development”，提出fru并不是求偶行为的开关，而是调控求偶神经环路的“调音师”，通过其表达模式和表达量，决定了求偶行为的模式。

eLife digest（eLife编辑部助评）: how to court a fly

该研究主要有三个发现：第一、fru基因在一段关键的发育阶段调控求偶神经环路的发育/构建，并直接决定其产生本能的异性求偶行为；第二、fru基因在成年阶段对异性求偶行为并不重要，但是可以抑制同性求偶行为的产生；第三、fru基因并不是求偶行为的“开关”，即有和无，而是决定了求偶行为的模式：后天习得性求偶（无fru）、本能异性求偶（正常fru）、本能同性求偶（fru整体表达低）、本能双性求偶（fru在部分神经元表达低）。

模型图：A: fru分别在发育阶段和成年阶段促进异性求偶和抑制同性求偶；B: fru的表达模式和强度决定了求偶模式：同性恋、双性恋、异性恋等。

这一发现进一步扩展了本实验室在2014年Cell论文中提出的行为决定的本能获得与后天获得的两套遗传机制。同时，这些发现对于重新认识单基因如何调控复杂本能行为提供了重要启示：即便是与生俱来的本能行为，其神经环路都存在重大可塑性；而一个基因如何赋予一套行为神经环路多样化的功能，将是后续研究的重点。

性，在绝大多数动物中以繁殖为目的，意味着生。性与死亡，或者说生与死，是生命的一种交替和平衡。自然界的某些动物，性与死亡有着直接关联：它们仅有一个交配季节，会在大量的交配之后死亡。这种繁殖方式虽然显得有些极端，但是也由于其有效性而被自然选择下来。与此不同的是，大多数动物都采用了较为温和的交配与繁殖策略，并不会因此导致生命的终止。两种繁殖策略，不同的行为选择，尽管可以从进化的角度上理解，但对其神经调控机制却知之甚少。

Neuroscience Bulletin 2020年第12期以封面文章发表了本实验室博士生高灿等人的研究论文“Sex and death: identification of feedback neuromodulation balancing reproduction and survival”，以雄性果蝇的交配行为为模型，探讨了这一科学问题。

Neuroscience Bulletin 2020年第12期封面

雄性果蝇的求偶与交配行为是一种本能行为，并受一个关键基因fruitless (fru)的调控。野生型雄蝇在没有任何社交经历的情形下遇见雌蝇，也能快速并完整的表现出所有求偶的步骤，并与之交配。本研究利用转基因果蝇，通过人为调控表达fru的神经元的神经活动以及基因表达，获得了很多有趣的发现。比如：（1）人为的轻度激活fru神经元会诱导雄蝇（即使在没有雌蝇的情况下）持续表现求偶行为，直至死亡；（2）上述雄蝇可以进食，但是能量的补充并不能避免其死亡；（3）上述雄蝇在持续求偶过程中兴奋性神经递质乙酰胆碱合成酶的表达减少，抑制性神经递质GABA转运酶以及神经肽F（NPF）的表达升高。我们认为这三个信号是过度交配行为对神经系统的反馈信号，以抑制可能导致死亡的进一步交配。确实，当在以上果蝇中敲低这些基因表达时，雄蝇的生存时间发生了相应的改变（如敲低乙酰胆碱合成酶时延长了上述雄蝇的生命）。

我们进一步发现，当单只野生型雄蝇同时面对10只雌蝇时，会在5个小时内与平均3-4只雌蝇交配，并在每次交配之后显著降低其求偶行为；而NPF敲低的雄蝇平均与6-7只雌蝇交配，且在每次交配完成之后并没有降低其求偶行为。这些结果提示NPF可能扮演了一个抑制过度交配的神经信号分子。有趣的是，以往的研究发现NPF是一个“奖赏”分子，其在交配后表达上升。同一个信号分子，既作为交配的奖赏信号，又作为抑制过度交配的刹车信号，把性与死亡联系起来，在一定程度上平衡了后代繁衍与自我生存。

Wu, S., Guo, C., Zhao, H., Sun, M., Chen, J., Han, C., Peng, Q., Qiao, H., Peng, P., Liu, Y., Luo, S. D., and Pan, Y. (2019) Drosulfakinin signaling in fruitless circuitry antagonizes P1 neurons to regulate sexual arousal in Drosophila. Nature Communications 10, 4770. [link]

神经科学的一个根本问题是解析动物在不同的外在环境刺激以及内在生理状态下，如何做出适当的行为选择。本课题组以果蝇为动物模型，研究外在环境刺激和内在生理状态如何整合，进而决定某种特定行为的输出与否。在本课题组之前的研究中（PNAS, 2012；Cell, 2014；Nature Communications, 2017；Neuroscience Bulletin, 2017），报道了一簇调控多种本能行为的控制中枢——P1神经元。P1是雄性果蝇特有的神经元（在雌性中不存在），它参与调控性行为、睡眠和自发运动等多种觉醒状态相关的行为。P1神经元是一个兴奋中枢，它整合多种兴奋性和抑制性的感觉刺激进而决定是否输出求偶行为；然而，是否存在一种反应内在生理状态的、抗衡兴奋性中枢的抑制性中枢呢？在这次的研究中，我们发现神经肽胆囊收缩素（Cholecystokinin，简称CCK；果蝇中为Drosulfakinin，简称DSK）响应多种生理状态并与P1神经元相互作用以抑制果蝇的性行为，揭示了果蝇性行为的促进与抑制神经环路的相互作用机理，有助于理解本能欲望的兴奋性与抑制性信号的互作机制。

胆囊收缩素信号在进化过程中非常保守，可以调节多种行为。在哺乳动物中，从肠道产生的CCK作用于大脑中的受体，以传递饱腹感信号，从而抑制进食；此外，CCK还参与调控伤害性感受、学习记忆、攻击性行为和抑郁样行为等。在果蝇中，和CCK同源的DSK具有类似的生理功能。在这项研究中，我们发现Dsk神经元在激活时能抑制果蝇90%的求偶行为，并且与求偶的兴奋性中枢P1神经元相互拮抗。P1神经元同时表达两个重要的性别决定转录因子Fruitless（Fru）和Doublesex（Dsx），并且只存在于雄蝇脑中。人为激活P1神经元时，雄蝇会处于高度觉醒的兴奋状态，其睡眠减少、运动增加、求偶和打斗增强。当同时激活P1神经元和Dsk神经元时，果蝇的觉醒兴奋状态会介于单独激活P1和单独激活Dsk神经元之间。在分子通路层面，我们发现Dsk神经元通过释放神经肽DSK并作用于其G蛋白偶联受体CCKLR-17D3（表达在包含P1的众多fru和dsx神经元中）以抑制求偶行为；在神经环路层面，我们在单细胞水平揭示了四对Dsk神经元对求偶行为的调控作用，并且发现这些Dsk神经元通过突触连接接收来自dsx神经元（包括P1神经元）的信号。有趣的是，从dsx神经元到Dsk神经元的突触传递信号依赖于果蝇过去几天所处的饲养环境，比如是否群居。我们进一步发现，DSK的表达受到众多生理状态的调控，比如进食、群居、衰老等，而这些内在的生理状态可能决定了Dsk神经元是否活化并与外在感觉刺激一起调控性相关行为的输出与否。

综上，该研究鉴定出了果蝇性相关行为的抑制分子和神经环路，并发现这条通路受多种内在生理状态调控；同时该抑制通路与感知异性的兴奋性通路相互作用，以平衡果蝇性行为的输出。

该研究的共同第一作者为博士后吴顺凡博士、郭超博士和博士生赵环。

模型图：外在感觉刺激与内在生理状态对果蝇性行为的协同调控

Guo, C., Pan, Y. & Gong, Z. Neurosci. Bull. (2019). Recent Advances in the Genetic Dissection of Neural Circuits in Drosophila. https://doi.org/10.1007/s12264-019-00390-9 [link]

Zhang, W., Guo, C., Chen, D., Peng, Q., and Pan, Y. (2018). Hierarchical Control of Drosophila Sleep, Courtship, and Feeding Behaviors by Male-Specific P1 Neurons, Neuroscience Bulletin, https://doi.org/10.1007/s12264-018-0281-z [link]

Commented by Margaret Ho, A Shared Neural Node for Multiple Innate Behaviors in Drosophila, Neuroscience Bulletin, 2018, 34: 1103. https://doi.org/10.1007/s12264-018-0311-x [link]

注：一等奖仅此一个

Chen, D., Sitaraman, D., Chen, N., Jin, X., Han, C., Chen, J., Sun, M., Baker, B.S., Nitabach, M.N., and Pan, Y. (2017). Genetic and neuronal mechanisms governing the sex-specific interaction between sleep and sexual behaviors in Drosophila. Nature communications 8, 154. [link]

媒体相关报道:

“性，还是睡？这是个问题” by 知识分子 [link]

“Do You Prefer Sleep Or Sex? Fruit Flies Know” by The Daily Beast [link]

“Sex or sleep? Tired MEN are more likely than weary women to choose rest over a night of passion, study suggests” by The Daily Mail [link]

“Sleep or sex? How the fruit fly decides” by Science Daily [link]

“Sleep or sex? The battle between the two could be wired into our brains” by The Journal.ie [link]