连接组学概述及Flywire在近期研究中的应用
连接组学概述及其常用技术
连接组学是生物技术的重要分支，旨在通过高精度成像与计算分析技术，系统解析生物体神经系统的结构连接与功能网络，构建从微观神经元到宏观脑区的完整连接图谱。其核心目标包括绘制神经回路的三维结构、解析突触级连接关系，并建立结构与功能的关联，为理解脑功能机制及神经系统疾病提供基础。
以下将概述连接组学的关键技术及其应用：
一、神经环路示踪技术：化学标记与形态追踪
传统神经示踪技术通过化学标记实现神经元通路的可视化。研究者将示踪剂（如辣根过氧化物酶HRP、荧光金、生物素化葡聚糖胺等）注入特定脑区，利用轴浆运输的顺行或逆行特性追踪神经纤维走向。顺行示踪剂从胞体向轴突末梢扩散，标记下游投射；逆行示踪剂则逆向标记上游输入源。此类技术可清晰呈现单个神经元的形态与连接路径，但存在显著局限：其一，无法特异性标记特定细胞类型；其二，跨突触能力弱，难以解析多脑区、多类型神经元形成的复杂网络。因此，示踪技术多用于局部环路研究，需结合其他方法完善全局连接图谱。
二、神经影像技术：非侵入式全脑成像
现代影像技术突破了传统方法的侵入性限制，实现了活体、全脑尺度的连接分析：
- 功能磁共振成像（fMRI）
通过检测血氧水平依赖（BOLD）信号，fMRI可间接反映神经元活动引发的血流变化，揭示不同脑区的功能协同模式。例如，静息态fMRI通过分析自发神经活动的时空相关性，绘制功能连接网络，广泛应用于认知研究与疾病诊断。
- 弥散张量成像（DTI）与纤维束成像
DTI基于水分子在白质纤维中的各向异性扩散特性，重建脑内神经纤维的走向。结合纤维束成像技术，可三维可视化长距离连接通路（如胼胝体、皮质脊髓束），解析脑区间的结构连接基础。然而，DTI分辨率有限，难以区分交叉纤维或微观结构细节。
- 电子显微镜（EM）与体积电镜（vEM）
电子显微镜凭借纳米级分辨率，是解析突触级连接的“金标准”。连续切片电镜技术可对脑组织进行超微结构重建，精确识别突触前、后成分及神经递质类型。体积电镜（vEM）进一步整合大视野成像，实现立方毫米级脑组织的密集重建（如果蝇中枢神经或小鼠皮层柱）。例如，线虫全连接组（302个神经元）的绘制即依赖电镜技术的逐层成像与三维拼接。但电镜数据采集与处理耗时极长，且需复杂样本制备（如高压冷冻固定），限制了其在大脑全尺度研究中的应用。
FlyWire平台创建基础
FlyWire (https://flywire.ai/) 创建于普林斯顿大学， 受到美国大脑研究计划的支持，平台创建后由世界各地的科学家进行FlyWire Connectome 的校对和注释工作。Murthy lab 与Seung lab 负责了FlyWire社区的搭建与目前的运营维护，两个实验室均位于普林斯顿神经科学研究院。
FlyWire 网站有详细列出运行使用的数据来源以及对应文献，包括全脑电子显微镜图像来源，自动检测突触连接技术，分层注释及细胞识别标签的来源，神经递质预测，基于NBLAST相似性评分等技术来源。接下来将简略讲述最初电镜数据的获得、自动识别突触与预测突触神经递质技术的开发。
FlyWire 利用了Davi Bock实验室现有的电子显微镜图像资源，关于此电镜图象采集的具体信息发表在2018年Cell上(Zheng, Zhihao et al.)。对于有100,000 个神经元的果蝇大脑来说只有电子显微镜(EM)可以将分辨率精确到突触水平，但因为黑腹果蝇的大脑相比于此前其他使用电镜成像的样品来说太大了，在这篇文章中研究者更换了更高速的 sCMOS 相机，并制作了一个定制的压电驱动快速平台，使得成像速度大大提高。研究者还构建了一个机器人自动运输和定位系统，可以自动更换样品。研究者使用得到的数据集对 MB 的内在神经元 Kenyon 细胞(KCs)的所有输入进行了重建，验证了图像的可用性。
得到果蝇全脑电镜数据集后下一个问题就是如何将2D的切片图像构建成3D模型。果蝇大脑的突触的大小通常比脊椎动物小，并且一个突触前位点多数连接到多个突触后位点，这给突触连接提高了难度。FlyWire使用Funke lab从电镜图片中自动识别突触的方法初步推断连接图谱。研究者使用卷积神经网络 （CNN）识别每层图像中的突触间隙，T 形杆，囊泡等结构，生成一个从该结构指向相应突触前位点的向量。人工识别突触方向也按照此原则。接着使用 CIRCUITMAP（左），在 CATMAID 中自动重建的神经回路。也是由于此原理局限，现在FlyWire所预测的突触连接均为化学连接而不包括电突触。
值得一提的是，后续FlyWire对每个神经元突触进行神经递质预测所使用的技术也为Funke lab 开发。虽然此前技术可以表现神经元之间的突触连接细节，但连接的突触之间传递的信息是兴奋性的还是抑制性的，这是由释放的递质决定的。研究者首先挑选出在以往研究中具有明确细胞类型与表达模式的六种神经递质（乙酰胆碱、谷氨酸、GABA、血清素、多巴胺、章鱼胺），将以往研究中相应神经元在光学显微镜下的位置与具有注释突触位置的相应电镜数据进行重建匹配，从而产生具有已知递质身份的突触位点的 EM 体积数据集。研究者使用该数据集来训练深度学习模型，接着使用经过训练的模型来预测迄今为止递质身份未知的神经元的突触的递质身份。结果显示该模型在不同分割等级的测试集上均有较高准确性。
2020年FlyWire平台上线，并发表了文章描述了FlyWire平台的运行模式与使用方法。使用自动识别突触连接的技术构建全脑连接组的准确性仍然需要再通过人工校对来提高，问题是人工校对的工作量十分大，因此FlyWire平台参照哲学围墙花园社区的运行模式，招募志愿者进行神经元校对。
终于在2023年七月，经过4 年，250 人的270 万次编辑，第一个完整的果蝇大脑连接组发布，并登上nature封面。
FlyWire平台在目前科学研究中的应用
随着神经科学和计算生物学的快速发展，FlyWire平台通过整合电子显微镜成像、人工智能驱动的神经元追踪技术以及大规模数据分析，成为果蝇（Drosophila melanogaster）神经科学研究的重要工具。以下从四个前沿研究方向，阐述FlyWire在果蝇神经科学研究中的关键应用。
- 解析果蝇求偶歌曲的神经网络组织
动物通过声音交流时，听觉系统需编码行为相关的声学特征以驱动特定反应。然而，由于听觉通路的复杂性，特征检测的神经机制长期存在争议。研究者利用FlyWire平台，首次绘制了果蝇听觉通路的首个神经元连接通路图，揭示了24种新型中间层细胞类型及其突触连接模式。研究发现，这些神经元对求偶歌曲的两种模式（正弦波与脉冲序列）表现出连续偏好，且不同偏好的神经元在非层级网络中高度互连。通过FlyWire的突触极性分析，进一步明确了该网络中兴奋性与抑制性连接的分布，为理解果蝇听觉编码的动态组织提供了新视角。
- 重构果蝇昼夜节律钟的突触连接组
生物钟网络通过协调生理与行为适应昼夜变化，但其具体连接模式仍不清晰。借助FlyWire平台，研究者将果蝇昼夜节律网络的已知神经元数量从150个扩展至约240个，并发现了新型背侧时钟神经元及对侧突触连接。此外，研究揭示了时钟神经元通过间接光输入通路接收环境信号，并调控摄食与生殖相关神经元的机制。结合单细胞转录组学数据，FlyWire还帮助鉴定了时钟网络中丰富的肽能信号通路，表明旁分泌信号在节律调控中的关键作用。这些发现不仅完善了果蝇生物钟的连接图谱，还提示了与脊椎动物生物钟通路的进化保守性，为疾病相关节律紊乱的研究提供了模型基础。
- 构建果蝇计算大脑模型以解析感觉运动加工
基于FlyWire提供的全脑连接组数据（包含12.5万个神经元和5000万突触），研究者开发了首个果蝇泄漏积分-发放计算模型（Leaky integrate-and-fire model），用于模拟味觉与机械感觉的神经加工过程。该模型成功预测了糖或水感应神经元激活后触发的进食行为回路，并通过光遗传学实验验证了其准确性。例如，模型预测的触角梳理回路神经元激活模式与实际观测高度一致。这一成果表明，仅依靠突触连接与递质信息即可构建可验证的神经回路模型，为理解复杂感觉-运动转换机制提供了新范式，同时也为人工智能领域的类脑计算模型开发注入新思路。
- 揭示蘑菇体Kenyon细胞的视觉输入多样性
果蝇蘑菇体（Mushroom Body）传统上被认为是嗅觉信息处理中心，但FlyWire连接组数据表明，其8%的Kenyon细胞主要接收多模态视觉输入。研究发现，这些视觉Kenyon细胞的突触前神经元具有大感受野，而中间神经元则传递空间受限的视觉特征信号。单个Kenyon细胞通过随机采样多个视叶神经元的输入，形成稀疏且分布式的视觉编码模式。此外，特定Kenyon细胞亚群表现出受限的输入组合，提示其对特定视觉刺激的偏好。这一发现颠覆了蘑菇体仅处理嗅觉信息的传统认知，揭示了其在视觉信息整合中的潜在作用，为理解昆虫多感觉整合机制开辟了新方向。
综上所述，FlyWire平台通过提供全脑尺度的突触级分辨率数据，正在推动果蝇神经科学研究迈向系统化与定量化。其在听觉通路、生物钟网络、计算建模及多感觉整合等领域的应用，不仅深化了对特定神经回路的理解，还促进了跨学科方法（如连接组学与计算神经科学的结合）的发展。未来，随着数据规模的扩大与分析工具的优化，FlyWire有望进一步揭示神经编码的通用原则，并为脑疾病机制研究、类脑智能开发提供关键支持。然而，如何高效处理海量连接组数据并实现动态功能验证，仍是该领域亟待突破的挑战。
本次journal club的 slides 见附件pdf：
by 李畅、王姣、邢丽敏