口服RNA干扰技术在农业害虫防治中的应用
害虫是满足全球粮食需求的重要制约因素也是传播各类疾病的媒介。由于虫害的直接或间接影响，所有农作物的潜在产量都受到重大影响。直接损害包括植物组织或器官的污垢、变形或坏死以及植物病原体的传播，而间接损害包括产量的损失和作物生产总成本的增加。
在没有控制措施的情况下，主要作物害虫造成的估计年总产量损失约占18%。害虫如棉铃虫、褐飞虱、蓟马的生态和生理特征，包括坚韧的外骨骼、小体型、飞行能力、高繁殖潜力和在不断变化的环境中的适应性使得其具有极强的危害性，大多数农业害虫都属于鳞翅目。
目前，采用不同的策略，如文化、机械、生物、化学和转基因方法，以有效控制害虫。其中，文化、机械和生物措施是传统方法，自古以来就被农民所遵循。然而，它们通常行动缓慢，需要熟练的人员，并且在给定时间只能应用于一小块区域。化学方法涉及使用有毒物质，这些物质通过抑制酶活性来干扰一个或多个重要途径。化学方法虽然更快、更有效但每年通过使用化学杀虫剂，在作物保护方面需要投入大量资金，且它们在环境中的持久性会导致环境和健康相关问题。与上述传统的害虫防治方法相比，转基因方法具有许多优势。它们在对抗害虫方面更具特异性，并在转基因植物中持续大量产生杀虫化合物。因此，就提高作物产量而言，转基因作物的苏云金芽孢杆菌Bt毒素能够控制害虫数量减少农作物损失并大大减少了化学杀虫剂的使用。 然而，害虫对杀虫毒素的抗性快速进化。
理想的害虫防治策略应该是经济、环保和农民友好的。它的作用应该是具体的，并且应该在不影响非目标生物的情况下针对大量害虫。该技术应该有另一种方法，以防害虫产生抗药性。为了实现理想的害虫防治方法，迫切需要探索其他可能的方法来赋予广谱抗虫性。 正常情况下，蛋白的产生过程是从DNA到RNA，再到蛋白质。RNA干扰是由双链RNA诱发，经过体内一系列作用，引起与之匹配的mRNA降解或表达受到抑制，使得蛋白表达受阻从而降低靶基因表达的一种生物学现象。2001~2002年连续两年被《Science》杂志评为年度十大科学进展，并在2002年排榜第一。该技术被认为是农业绿色防控中最具有应用潜力的生物技术之一。早在1990年，就已经有科学家在植物中发现基因沉默的现象。那时，这个研究小组原本是想得到颜色更深、更鲜艳的矮牵牛花。于是，他们就把一种叫「查尔酮合成酶」的基因，转进矮牵牛花当中。查尔酮合成酶是一种在矮牵牛花中控制积累色素的蛋白，通常可以使花表现为粉色或者紫色。然而让他们没想到的是，他们不但没得到颜色更深的矮牵牛，反而出现的竟是白色或者白紫色的。面对植物学领域出现的一系列不可思议的基因沉默实验结果，华盛顿卡内基研究所胚胎学部39岁的安德鲁·菲尔，马萨诸塞大学癌症中心38岁的克雷格·梅洛决定研究基因的表达究竟是如何被控制的。1998年2月19日，两位遗传学家和同事在英国《自然》杂志上发表了一篇题为《双链RNA在秀丽隐杆线虫中有力而独特的遗传干扰作用》的论文。2006年两人被共同授予诺贝尔生理学及医学奖。
诱发RNAi的分子可分为siRNA、miRNA和piRNA。双链RNA被一种名为Dicer的蛋白质识别并与之结合在一起，Dicer将双链RNA切割成碎片般的小片段。之后，小片段与另一种名为RISC的蛋白质结合在一起，RISC会去除双链RNA小片段中的一个链，只留下单链RNA与自己在一起。结果，这种RISC复合体像侦探一样探测mRNA分子，一旦mRNA与自己的RNA片段所携带信息匹配，RISC复合体就将它与自己结合起来，把它切割片断并导致mRNA 降解，通过这种干扰与害虫生长发育相关基因的转录和翻译过程，使害虫关键基因发生沉默，阻止蛋白质的合成，导致害虫的环境适应能力降低或者死亡，最终达到控制害虫的目的。
常见的RNAi技术在农业中的应用主要分为三类：寄主诱导的基因沉默（host-induced gene silencing，HIGS）、病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silencing，VIGS）和外源dsRNA诱导的基因沉默(Exogenous dsRNA-induced gene silencing，EdIGS)。HIGS通过转基因作物来表达针对害虫或病原物的dsRNA。VIGS通过携带特定基因片段的重组病毒侵染宿主的过程来生产sdsRNA。EdIGS更类似于传统农药的施用方法，通过非转基因手段，直接向环境中喷施或注射外源dsRNA，通过害虫取食或病原体侵染的过程而起作用。通过使用有效的递送方法可以实现成功的RNAi反应。迄今为止，在不同生物体中已有的dsRNA递送方法包括直接摄入，幼虫浸泡（最有可能通过摄入发生），纳米颗粒介导的壳聚糖或其他纳米颗粒摄取，以及细菌和酵母等微生物表达的载体系统。然而，该技术在广泛应用之前需要解决高效微生物dsRNA生产系统选择的问题。例如微生物介导的dsRNA表达系统的应用常见的含有大肠杆菌dsRNA表达系统、酿酒酵母dsRNA表达系统、昆虫共生细菌dsRNA表达系统。
深究RNA干扰技术的机制，实为RNA干扰过程中，将双链RNA构建到质粒中，然后转染进细胞，或者直接使用含有双链RNA的溶液喷涂植物，让害虫吸收双链RNA达到RNA干扰的效果。或者培育工程菌共生的农作物，同样能够在害虫吃作物时摄入干扰RNA，从而达到害虫防治的效果。在这个过程中，RNA干扰被分为两类。细胞自主RNAi和非细胞自主RNAi。细胞自主RNAi是指发生在细胞内的RNAi，而非细胞自主RNAi需要将沉默信号从一个细胞到另一个细胞和从一个组织到另一个细胞的摄取和/或运输到细胞内。非细胞自主涉及环境RNAi现象，通过浸泡或喂食的环境暴露触发RNAi。
将携带干扰RNA的菌种或溶液有效输送到害虫体内是保证RNAi防治害虫的关键步骤，目前主要有五种方式，包括基本递送方式，阳离子脂质体协助运输，纳米颗粒运输，共生体运输，转基因植物运输。目前应用最为广泛的是基本递送方式和转基因植物运输。基本递送方式有两类，首先是显微注射，它可以高效的将干扰RNA输送到目标位置，1998年第一类显微注射的成功为该技术商业化提供了基础；第二类是喂食的方式，将含有干扰RNA的菌液或将干扰RNA直接混入昆虫事物，同样能达到RNAi的效果。前提是需要将目的基因的dsRNA装载到合适的质粒上转染入细菌，后续供害虫取食吸收。如在甜菜叶蛾幼虫中喂食含有SeCHSA（几丁质合成酶）基因的dsRNA，可以引起角质层分层。同时SeCHSA是一个非中肠基因，摄入dsRNA成功实现基因沉默，表明可以诱导全身性RNAi。转基因植物输送方式第一例是在玉米中完成的，通过设计针对西方玉米根虫的致死性基因的dsRNA，并体外确认有效后转染进质粒构建转化体玉米，达到害虫防治的效果。
害虫在摄入dsRNA后，通过中肠上皮细胞吸收进入细胞并扩散到全身，条件性的触发系统性RNAi。在线虫中，由哈佛大学的克雷格亨特发现第一个11跨膜的通道蛋白SID-1基因负责线虫的系统性RNAi，随后又发现了在线虫肠道表达的SID-2蛋白负责从环境中吸收dsRNA进入中肠，因此发现了线虫环境性RNAi和系统性RNAi的机制。而在昆虫中，如马铃薯甲虫，发现了两个sid-1样基因，silA和silC，有类似线虫sid-2基因的功能，能将外界dsRNA吸收入甲虫中肠。有些昆虫可以通过内吞的作用吸收外界dsRNA，如在粉红甲虫中，通过将网格蛋白依赖的内吞作用抑制剂，能有效的阻止害虫对dsRNA的吸收。在后续的研究中发现，昆虫的这种内吞作用是由清道夫受体介导的，使用清道夫受体竞争性抑制剂同样能够阻止网格蛋白依赖的内吞作用。
昆虫的系统性RNAi因为物种差异而表现出不同的方式，如农业害虫褐飞虱，通过sid-1样基因介导系统性RNAi，但dsRNA是如何输出细胞并从细胞间转运的，目前还不清楚。由于有些昆虫没有sid样基因，所以不清楚喂食dsRNA发挥作用的具体机制。但在果蝇S2细胞中，已发现一种新的细胞间传递dsRNA的方式。S2细胞间会形成一种纳米管道样结构，可能负责在细胞间传递dsRNA。
昆虫细胞在吸收dsRNA后，会触发细胞自主性的RNAi。通过该机制来达到RNAi的目的。
将口服RNAi技术应用于害虫防治还面临许多挑战，接下来将从dsRNA稳定性，口服RNAi效率和口服RNAi的使用成本几个方面阐述。
dsRNA的稳定性不仅决定昆虫是否能够顺利摄取到dsRNA还涉及到未被摄取的dsRNA是否能够在一定时间内降解减少周围环境其他生物的接触。这包括施用dsRNA后其在环境中的稳定性以及dsRNA被昆虫摄入后在其肠道跟淋巴液中的稳定性。不同浓度的dsRNA在不同土壤中的降解基本都在24h左右。在温室环境的马铃薯叶片上能够存在至少28d。强紫外线照射可以使dsRNA在2h内迅速降解。所以环境中的dsRNA稳定西非常依赖于其施用介质和环境。在昆虫肠道中，酶解和化学水解会导致dsRNA的降解，而通过包裹dsRNA递送会显著延迟降解时间。饥饿等压力刺激也可以通过改变肠道环境如PH等降低dsRNA的降解。在淋巴液中，有些昆虫的dsRNA酶表达较高也会导致dsRNA无法在淋巴中稳定存在。
RNAi的效率在不同的昆虫中不同，一方面是因为上面提到的不同昆虫体内dsRNA稳定性不同，另一方面就是不同昆虫主动摄取dsRNA以及dsRNA在体内处理和传递的各种分子的表达存在差异。除此之外，dsRNA的设计对RNAi的效率也十分重要。在大多数昆虫中，相对较长的dsRNA分子更容易被肠道上皮细胞主动吸收。口服RNAi的靶标特异性也主要受到dsRNA的序列特异性影响。口服RNAi方式防治害虫跟化学农药一样都会使昆虫产生抗药性。除了目标基因的突变，昆虫还可能通过突变摄取以及处理dsRNA的关键基因产生对口服RNAi的直接抗性。
使用口服RNAi的经济成本还是较高的，目前能够产生目标基因dsRNA的转基因作物被认为是最便捷的口服RNAi防治害虫方法。实验室中更多的是直接体外转录产生dsRNA。依赖于细菌和酵母等能够自主产生dsRNA的微生物递送系统被认为是直接施用dsRNA害虫防控的非常有前景的方式。但在实验室中确定害虫靶基因和优化RNAi效率才是使用口服RNAi方式防治害虫的最初步骤，后期还要进一步进行田间测试，规模生产，毒性评估，提高使用者的接受度和扩大田间测试等直到最后的产品完成注册。
本次journal club的 slides 见附件pdf：
by 朱培雯、苏祥彬、纪小小