在本次主题为“MicroRNAs: The Victor of Nobel Prize Arena”的Journal中，我们深入探讨了microRNA（miRNA）这一分子领域的革命性发现及其在生物医学中的深远影响。Journal内容分为三个核心部分：
首先介绍了microRNA的生物合成过程，以及2024年诺贝尔生理学或医学奖得主Victor R. Ambros和Gary Ruvkun在这一领域的开创性工作。他们的研究不仅揭示了microRNA在基因表达调控中的关键作用，而且通过秀丽隐杆线虫模型，展示了microRNA如何通过碱基互补配对抑制翻译的机制。
随后，本次Journal聚焦于microRNA在个体发育、神经发生和行为控制中的多重功能。我们讨论了let-7 在果蝇性别分化、昼夜节律调节中的作用，以及microRNA如何影响神经元细胞命运的特化和功能多样化。此外，还探讨了microRNA在行为控制中的作用，包括影响生物体的姿势和生物钟节律。
最后，本次Journal深入分析了microRNA在神经退行性疾病中的失调及其治疗价值。我们审视了let-7在阿尔兹海默症中的炎症反应，miR-29b-3p在亨廷顿疾病中的自噬过程调节，以及miR-205在帕金森疾病中对LRRK2蛋白的调控作用。这些讨论不仅增进了我们对microRNA在神经系统疾病中作用的理解，而且为未来的治疗策略提供了新的方向。
通过这次Journal，我们得以全面了解microRNA的生物学意义，以及它们在医学研究和临床应用中的潜力。
Part I: microRNA的生物合成过程以及2024年诺贝尔生理学或医学奖得主工作介绍
2024 年10 月 7 日北京时间 17 时 30 分许，两位美国科学家维克托·安布罗斯（Victor R. Ambros）和加里·鲁夫昆（Gary Ruvkun）因发现微 RNA （microRNA）及其在转录后基因调控中的作用，获得 2024 年诺贝尔生理学或医学奖。他们当时的工作于1993年以背靠背的形式同时发表在了《cell》杂志上，并将第一个被发现的microRNA命名为lin-4。二位科学家以秀丽隐杆线虫为动物模型，通过lin-4基因和lin-14基因突变体的表型推测二者具有一定的相关性，在进一步的研究中证实了lin-4基因通过编码一种短的长度在22 nt左右的RNA，命名为lin-4 microRNA，能够以碱基互补配对的方式结合到lin-14基因mRNA的3‘UTR区域抑制翻译。揭示了microRNA以转录后修饰的途径调控靶基因表达的机制。随之而来的重大问题是，microRNA的存在是保守的吗，还是仅在线虫中发挥功能，鲁夫昆在00年将研究成果发表在了《nature》上，同时也发现了另外一类目前在病理学，发育，行为学上研究均十分广泛的microRNA—let-7，let-7在保守性上与lin-4不同的是，它在大多数物种中均能被检测到，而lin-4只存在于线虫中。进一步的说明了microRNA的转录后修饰途径是普遍存在的。
MicroRNA的基本概念：
1）什么是microRNA。microRNAs就是一种内源性的长度在22 nt左右的单链RNA分子，能够靶向结合mRNA并阻断翻译或者降解RNA。
2）microRNA的发生和功能。发生：microRNA基因通过RNA聚合酶II转录成不同长度（通常为1000-3000个核苷酸）的初级microRNA （pri-miRNA）。随后，pri-miRNA被核糖核酸酶（RNase） III Drosha-DGCR8核复合体切割成长度为60-100个核苷酸的发夹RNA，称为前体miRNA （pre-miRNA）。第三，pre-miRNA通过export -5从细胞核转运到细胞质，并进一步被RNase III酶Dicer切割发夹，形成长度约为22个核苷酸的不完全microRNA双链。最后，microRNA双链解旋，成熟的单链microRNA整合到RNA诱导沉默复合体（RISC）中；功能：miRISC引导miRNA的反义链 ，以便与目标信使RNA （mRNA）序列互补，形成双链螺旋。在植物中，通常发生miRNA与mRNA完全配对引起的RNA降解过程，miRISC复合物结合后，会在mRNA 3‘ 端募集去腺苷化酶复合物，然后去掉Poly A尾巴。去腺苷化后，5’ UTR发生脱帽反应，最后，5 ‘ -3 ’核酸外切酶导致mRNA降解。
在动物中，通常发生miRNA与mRNA不完全配对引起的翻译抑制过程，翻译抑制是由于miRNA在翻译的不同步骤受到了干扰。AGO蛋白已被证明与5′ capping蛋白因子竞争，在起始阶段阻断翻译。miRNA作用的其他机制涉及延伸步骤，导致蛋白质过早终止。
第一个microRNA—lin-4的发现：
Ambros（以Ambros文章为例）将第一个被发现的microRNA—lin-4的工作于1993年发表在了《cell》杂志上。他们根据线虫lin-4基因突变体和lin-14基因突变体表型的互补性、lin-4基因突变体中生命后期LIN-14蛋白的异常高水平及LIN-14蛋白水平需要lin-4 的反式作用和LIN-14 3 ‘ UTR区域的顺式作用，推测lin-4基因产物通过lin-14 3′ UTR直接或间接地抑制lin-14 mRNA的翻译。作者对包括秀丽隐杆线虫在内的四个种的线虫的lin-4基因进行测序并比对，找到了能与lin-14 mRNA 3’ UTR区域反向互补的序列。对序列进一步分析发现，全长693bp的 lin-4基因，不含有起始密码子和终止密码子和选择性剪接位点，说明了该基因可能不具备编码蛋白质的功能。随后通过Northern blot实验找到了lin-4S和lin-4L两类转录本，鉴定了lin-4成熟microRNA的序列，为22 nt左右。并说明了Lin-4以不完全匹配的方式与lin-14mRNA 3‘UTR区域的重复序列进行结合，发挥反式作用因子的功能。
MicroRNA的调控：
1）植物中microRNA生物发生的调控
类似的转录、5’ 端capping、 3’ 聚腺苷化和编码基因的剪接特性表明，基本上所有已知的 mRNA转录调控机制都可以应用于MIR基因转录。因此在microRNA产生过程中涉及到的分子，都可能作为调控microRNA表达的因素。
2）microRNA的稳定
作为一种自我保护机制，mRNA转录后具有一个5‘ 帽和一个 3’ poly(a)尾巴，这确保了它们的核输出并促进翻译起始。成熟的microRNA缺乏这种结构，但在其3‘ 端有2-O-甲基化修饰。这种由HEN1催化的修饰是植物miRNA 稳定的关键一步。ATRM2参与未甲基化miRNA/miRNA的降解，可能在RISC加载启动期间发生。
3）microRNA sponges
环状RNA（circRNAs）是真核生物中共价封闭的内源性生物分子，具有组织特异性和细胞特异性表达模式，其生物发生受特定的顺式作用元件和反式作用因子调控。环状RNA可以作为microRNA海绵或诱饵，保护目标mRNA免受miRNA依赖性降解。因此靶RNA更容易被核糖体积极翻译和结合。
总结：miRNA的发现是遗传中心法则的进一步补充，功能受到多种蛋白因子和circRNA的调控。
Part II：microRNA 在个体发育、神经发生和行为控制中的多重功能
作为基因表达调控的关键因素，microRNA在生物体的成长和生理机能中扮演着多重角色，其影响力贯穿于各个发育阶段和各种生理活动的始终。接下来我将概述microRNA在个体发育（ontogenesis）、神经发生(neurogenesis) 和行为控制(behaviour control)中的作用。
个体发育是生物体从受精卵到成熟个体的发育过程，其中性别决定是一个至关重要的环节。果蝇是研究性别决定的一个经典模式生物。2014年Fagegaltier等发现性别二态性表达的microRNA-let7在果蝇性别分化及维持中都有重要参与作用。研究者首先对雌雄果蝇不同身体部位和器官（包括头部，身体，生长器官和唾液腺）内表达的microRNA进行测序，发现很多microRNA的表达都呈现明显的性别差异性。为了进一步探究性别二态性表达的microRNA的重要性，研究者专注于研究let7，这是一种在果蝇的大脑和生殖器官中高度富集且表现出显著性别差异的microRNA。该研究揭示了let7在果蝇个体发育中的关键作用：
1）let7突变体的雌雄果蝇在外生殖器形态上都有一定的缺陷；2）利用dsx-gal4系统驱动let7在果蝇体内过表达时，无论是雄性还是雌性，它们的腹部A8至A10体节（这些体节包括了外生殖器的部分）都出现了发育不全的现象；3）特别值得注意的是，在let7突变的果蝇中，涉及到性别决定途径的关键基因，包括sxl、dsx和yp1，它们的表达水平出现了异常。这表明let7可能在性别决定的生物学过程中发挥着重要的作用。有趣的是，研究者还对果蝇性别维持的机制进行了深入研究。他们利用了一种温度敏感的蜕皮激素减少的果蝇突变体(ecd1ts), 这种突变体在特定的高温条件下能够阻止蜕皮激素的合成。蜕皮激素是一种对昆虫发育至关重要的激素。在实验中，研究者们在成熟果蝇中人为地造成了蜕皮激素的缺乏，并在三天后观察了这一变化对果蝇的影响。他们特别关注了let-7，以及性别决定途径的关键基因，包括sxl, tra, dsx,yp1等。结果显示，这些基因的表达水平在蜕皮激素缺乏的情况下出现了变化。这些发现揭示了蜕皮激素在果蝇性别维持中的潜在作用，并且指出了let-7可能在这一过程中扮演的重要角色。通过这项研究，我们对性别决定和维持的复杂生物学机制有了更深入的理解。值得一提的是：microRNA表达的性别二态性不仅仅存在于果蝇中，在小鼠和鸡的性腺中也鉴定出microRNA表达的性别二态性。哺乳动物中性别差异表达的microRNA的作用仍有待进一步研究。
另一个关于microRNA在性别决定中作用的有趣研究是在线虫里开展的，研究者发现: 母源性microRNA（mir-35）在胚胎发育早期通过抑制关键性别决定基因her-1的表达, 从而给受精卵足够的时间去识别性染色体与常染色体的比列，避免过早的性别决定的发生，确保性别决定的准确性和及时性。
在神经发生（neurogenesis）过程中，microRNA同样扮演着关键角色。它们影响神经元细胞命运的特化（neuronal cell fate specification），并促进神经元亚型（neuronal subtypes）和神经元功能（neuronal functions）的多样化分化，这种多样化对于构建复杂的神经系统和实现多样的神经功能至关重要。
果蝇的蘑菇体神经元分为γ、α′/β′和α/β三类亚型，它们在不同发育阶段依次成熟。研究表明，未成熟的蘑菇体神经元内表达的特有的转录因子(如：在γ类神经元内特有的转录因子Abrupt以及在γ和α′/β′内呈梯度表达的Chinmo)决定它们分化成那种神经元亚型。在蛹期早期阶段，由蜕皮激素Ecdysone诱导的let-7的表达，可以抑制Abrupt以及Chinmo在α/β类神经元内的表达，促使磨菇体神经元向α/β类神经元的分化。
线虫的ASE味觉感觉神经元是一对儿形态完全对称但功能却并不相同的神经元：ASE左（ASEL）感知Mg2+、Li+和Na+的浓度变化，而ASE右（ASER）则对Br−、I−和Cl−有反应。两个神经元中化学感知受体gcy基因的不对称表达与ASE神经元的功能不对称性相关。研究者发现两个microRNA (mir-273和lsy-6) 通过转录后调控，特异性影响ASEL和ASER中gcy基因的表达，导致这两个结构对称的神经元功能分化。
此外，microRNA还参与行为控制（Behaviour Control），包括影响生物体的姿势（Posture）和生物钟（Circadian）节律。这些行为特征对于生物体的生存和适应环境具有重要意义。
Claudio R Alonso实验室先后于2015年和2019年分别在Science 和Current Biolody上发表了两篇microRNA（miR-iab4）参与调控果蝇自我扶正行为的文章。miR-iab4突变体果蝇幼虫丧失了自我扶正能力。进一步的研究表明，miR-iab4通过抑制Ubx基因表达，调节SRN运动神经元的活性，从而影响自我扶正行为。有趣的是，成体果蝇也采用这一相同的分子和神经机制来控制自我扶正。值得注意的是，Claudio R Alonso实验室最近开展的遗传筛选结果显示，近40%的microRNA参与调控果蝇幼虫的自我扶正行为，这表明microRNA在行为调控中可能存在广泛的协同效应。
目前对microRNA在果蝇昼夜节律调控中的作用的研究已经取得了丰富的成果。microRNA在调节果蝇的生物钟神经元活动以及影响昼夜节律相关行为的表现中扮演着关键角色。2014年一篇发表在Nature Communication上的文章揭示了进化上高度保守的microRNA（let-7）参与调控果蝇昼夜节律的分子机制。研究显示，let-7在果蝇脑中的生物钟神经元内高表达，其过表达会导致果蝇的昼夜周期延长，而let-7的功能缺失则会降低果蝇早晨活动高峰。研究者们进一步发现，果蝇的核心时钟蛋白CLK/CYC、PTTH和蜕皮激素20E共同构成的信号通路，通过EcR受体影响let-7的昼夜节律性表达。let-7通过抑制CLOCKWORK ORANGE (CWO)基因的转录和翻译，进而精细调控果蝇的昼夜节律。
microRNA的这些功能不仅对于理解生物体的发育机制具有重要意义，而且对于揭示行为控制的分子基础也提供了新的视角。通过深入研究微RNA在这些过程中的作用，我们可以更好地理解生物体如何通过基因调控来实现复杂的发育和行为模式。这些知识不仅有助于我们揭示生命科学的基本原理，还可能为治疗相关疾病提供新的策略。
Part III：microRNA在神经退行性疾病的研究进展及其在临床应用上的价值
神经退行性疾病的共同特征是变性的蛋白在神经元中沉积，导致神经元功能出现障碍，进而产生运动或相关行为的精神缺陷。阿尔兹海默症（Alzheimer’s disease, AD）是全球最常见的神经退行性疾病之一，众多的文学和影视作品已对其临床表现进行了详尽的描述。它最显著的临床表现为记忆力的丢失。在AD病人大脑中，皮层和海马区萎缩，神经元内β-淀粉蛋白聚集成寡聚体进而形成斑块样沉积，同时Tau蛋白过度磷酸化形成纤维状蛋白，无法被神经元自身或胶质细胞降解，诱发神经炎症，促进神经元的死亡。Toll样蛋白受体是介导细胞免疫应答的自身免疫受体。病毒中的ssRNA能激活细胞内TLR7/8受体，进而激活细胞内NF-κB信号途径，促进免疫细胞释放促炎因子TNF-α。HIV病毒ssRNA40末端激活TLR7受体的序列GUUGUGU与microRNA let-7 3’端序列片段高度相似，研究人员试图探索let-7能否通过激活TLR7激活细胞炎症应答。在免疫细胞培养基中外加let-7，能够导致其释放TNF-α。在神经元培养物中添加let-7，会导致神经元活力下降，神经元出现凋亡。在死亡的神经元培养基中，能够检测到高含量的let-7，将这种培养基添加到神经元培养物中，同样会造成神经元的死亡。在AD病人的脑脊液中也能够检测到高表达的let-7水平。这些结果共同证明了，let-7能激活TLR7受体，从而促进神经退行的发生。另外，在AD病人脑脊液中还检测到miR15表达量下降，通过microRNA算法预测并通过western blot验证了miR15识别下游靶基因ERK1。当激活ERK1时，Tau蛋白磷酸化水平上升。除了let-7和miR15，还有多种miRNA已在AD模型小鼠和病人的样本中检测到发生了不同水平的变化。
第二种神经退行性疾病——亨廷顿疾病（Huntington’s disease, HD）的临床表现为步态不稳和肢体出现不自主地运动，所以亨廷顿疾病又被称为“舞蹈症”。它的病理特征是编码亨廷顿蛋白的基因（HTT）末端出现高度重复的CAG片段，当重复对数达到40以上时会形成多聚谷氨酰胺链（polyQ），导致蛋白构象发生改变，使得HTT蛋白沉积在神经元内，造成神经元损伤。在非神经元细胞中许多神经元基因被REST蛋白（RE1 silencing transcription factor，REST）抑制表达，研究发现，REST能抑制miR9*和miR124的表达，解除其对染色质重塑复合物成员BAF53a的抑制，抑制BAF53b的表达，促进非神经元细胞的发育。在细胞中过表达miR9*和miR124则会同时抑制REST和BAF53a表达，解除对BAF53b的抑制作用，促进神经元细胞的发育。基于这个原理，研究人员创造了一项技术能够将人类成纤维细胞重编程为神经元细胞。将健康人群和HD病人的成纤维细胞重编程为神经元细胞，通过microRNA测序结果分析，miR29b-3p在晚期HD病人重编程神经元中高表达，经算法预测，找到同源性较高的靶基因STAT3，在晚期HD病人神经元中，STAT3的转录水平较低。进一步，对HD神经元致病机制进行研究，发现在HD病人重编程的神经元中，自噬受到严重抑制。使用miR29b-3p抑制剂治疗后，能够提高细胞中自噬水平，而敲降STAT3后，自噬受损。这些结果表明，在HD神经元中，miR29b-3p表达上调，抑制了STAT3的表达，阻碍了神经元中的自噬过程，诱导神经退行的发生。
帕金森疾病（Parkinson’s disease，PD）是另一种常见的神经退行性疾病。PD病人表现为运动迟缓，肌肉僵硬和出现静止性震颤。它的病理特征是中脑黑质致密部多巴胺能神经元的丢失以及在多巴胺能神经元中出现α-突触核蛋白（α-Synuclein，α-Syn）错误折叠形成的路易氏小体（Lewy’s body）的聚集。它的病因主要包括环境因素、衰老，以及遗传因素。一些基因如LRRK2、SNCA、Parkin、Pink1等的突变会导致PD的发生。接下来，重点介绍microRNA对LRRK2的调控作用。在PD病人的脑脊液中检测到高水平的LRRK2蛋白的表达，通过算法预测，找到与lrrk2结合的miR205。在PD病人的脑脊液中，miR205的表达水平显著降低，与lrrk2的表达水平呈负相关的关系。PD病人携带的LRRK2突变体有G2019S和R1441G这两种形式，在G2019S突变的情况下添加miR205，并不能修复神经元的数目，而在存在R1441G突变的情况下添加miR205，则恢复了神经元的数目，即miR205通过抑制LRRK2的激酶功能调节LRRK2的作用。另外，研究人员使用果蝇作为模式生物探究LRRK2的功能。在GFP后连接let-7识别的序列，通过UAS-EGFP-let-7-3′UTR这个报告基因检测let-7的活性。他们发现在果蝇中过表达dLRRRK的激酶结构域突变体蛋白会抑制let-7的活性，而敲降dLRRK的表达，则增强了let-7的活性，这说明LRRK2对let-7的拮抗功能是激酶依赖性的。但是过表达dLRRK的激酶突变体不会影响let-7的mRNA水平，研究人员发现LRRK2是通过影响了RISC复合物进而影响let-7的活性。同时，LRRK2的激酶突变体导致了E2F1/DP的表达量上调，而E2F1/DP又是let-7和miR184*的靶基因。这些结果证明了LRRK2通过影响RISC拮抗let-7和miR184*，导致E2F1/DP蛋白水平上升，促进了神经元的死亡。
在临床应用方面，microRNA可以被用来诊断疾病和预测疾病阶段，但是它也存在着一些治疗风险。随着技术的迭代，研究人员发明了一种环形滚动放大技术（Rolling Circular Amplification，RCA）扩增microRNA，相较于传统的qPCR，这项技术能够更快捷灵敏的检测到microRNA的信号，使用简易的装置即可观察到随浓度升高而上升的microRNA信号。同时也能使用试纸直接观测到microRNA的表达水平。这项技术对于未来通过microRNA作为生物标志物检测疾病提供了重要的检测手段。提示患病风险是为患者争取最佳治疗时间的方法。在临床上，AD分为两种，一种是常染色体显性单基因突变的早发性AD（early-onset autosomal dominant AD，ADAD），另一种是散发性晚发AD（sporadic late-onset AD，LOAD）。ADAD病人常携带APP、PSEN1或PSEN2这三种基因之一的突变，而LOAD病人很少发现其携带某种基因的突变，已知的有APOE基因突变。LOAD病人大约在70岁之后开始发病，占总AD病例的95%。急需一种方法能够模拟LOAD的病理情况，深入对其致病原因进行探究。使用成纤维细胞重编程为神经元的技术，能够在体外将AD病人的成纤维细胞重编程为神经元细胞，同时能在ADAD和LOAD病人的样本中复刻出Aβ蛋白沉积和神经元凋亡的现象。这种造模方式为LOAD的研究提供了良好的技术方法，也对未来在疾病早期判断风险人群是否患有LOAD提供了新的思路。
核酸药物在基因治疗的层面发挥作用。除了microRNA能够抑制基因的表达之外，在2006年获得诺贝尔生理学奖的siRNA，同样也起到基因沉默的作用。但是二者之间存在着不同之处：1.二者来源不同。microRNA主要由细胞内编码microRNA的基因经一系列加工生成，而siRNA主要由人为设计的dsRNA引入至细胞内经加工生成。2.二者识别靶基因的方式不同。siRNA能够完美与目标mRNA配对，导致mRNA降解。而microRNA既能与mRNA发生不完美匹配，又能与之发生不完美配对。当microRNA完美识别mRNA时，导致mRNA降解；当microRNA不完美识别mRNA时，则抑制mRNA的翻译过程。在药物研发阶段，microRNA药物难以通过临床III期实验，但是siRNA药物已有上市应用的例子。造成这种差异的原因主要是因为microRNA与mRNA不完美匹配识别的机制，导致microRNA在除了识别设计需要的靶基因之外通常会识别到大量的非理想基因，进而产生严重的不良反应。而由人为设计的siRNA几乎不会发生这种情况。另外，经注射引入至体内的microRNA还可能引发内源性microRNA的竞争作用，导致mRNA的翻译无法被抑制。因此，microRNA作为药物在临床应用还处在初期阶段，还需要大量的工作对其进行研究和设计。
Journal 总结：
本次Journal，我们全面探讨了microRNAs（miRNAs）的多方面影响和潜力。从Victor R. Ambros和Gary Ruvkun的诺贝尔奖获奖工作出发，我们深入了解了miRNAs的生物合成、它们在基因调控中的关键作用，以及在个体发育、神经发生和行为控制中的多重功能。此外，会议还聚焦于miRNAs在神经退行性疾病中的失调及其治疗价值，展示了miRNAs在阿尔兹海默症、亨廷顿疾病和帕金森疾病中的重要作用。本次Journal同样指出了microRNA作为疾病治疗靶标的潜在缺陷，包括在识别靶基因时可能产生的非特异性结合，以及可能引发的内源性microRNA竞争作用，这些因素都可能影响治疗效果并带来不良反应。尽管如此，miRNAs作为生物标志物和治疗靶点的潜力仍然巨大，为神经退行性疾病的诊断和治疗开辟了新的道路。未来的研究需要克服这些挑战，以实现miRNAs在临床应用中的最大化效益。
By 关文月