生命科学的发展极大依赖技术和研究手段的革新，从人类第一次观测到细胞离不开显微镜的发明发展，到现如今随着 CRISPR/Cas9的研究，我们不仅可以很便利的对传统模式动物进行基因操控，还能够对一些其他我们感兴趣的生物进行基因层面的编辑，比如转基因蚂蚁，转基因蟑螂等等。基于此，我们尝试对神经环路的研究方法和技术进行总结，希望能够帮助实验室的同学或者梳理或者拓宽一点点思路。本次汇报的主要架构根据Principles of Neurobiology 1st edition 的第十三章内容而来，但具体技术做了很大调整。
模式动物的选择取决于想要研究的科学问题。线虫作为结构较为简单，神经元数量较少的模式动物，已经完成了连接组图谱的绘制（使用电镜方法)。新兴的研究对象蚂蚁，由于它们具有分工严明的社会结构而用于研究其社会行为，且种群中不同工种的蚂蚁往往具有相同的基因组，所以也被尝试用来解答表观遗传学和行为之间的关系。斑马鱼作为脊椎动物和人类有更高的保守性，其神经再生性是研究的热门。在西方国家对于非人类灵长类的研究投资日益缩减的情况下，我国对于非人类灵长类的研究投资逐步增多，且又由于没有动物保护组织的干扰，越来越多从事相关研究的科学家选择在中国进行实验。
在基因和分子方法中，主要介绍了两类研究思路，loss-of-function和 gain-of-function。在 loss-of-function 的研究思路下，科学家通过研究突变果蝇来揭示特定基因的功能。突变果蝇的制作中，经典的方法是同源重组（到2015年仍被广泛使用），如今的首选是CRISPR/Cas9技术。在 gain-of-function 中，技术依赖的重点是如何人为操控基因的表达，由此引出果蝇中常用的几类表达系统和一些应用。除此以外，有时我们还需要知道蛋白的表达情况。主要方法有immunostaining和 western blot。研究蛋白的表达情况除了直接标记蛋白，还可以通过标记 mRNA 的方法。近两年发展出的果蝇全脑原位杂交技术，则可以通过设计荧光探针的方法，对全脑的特定 mRNA 进行空间和表达量的测定。
神经环路的研究中很重要的一类技术是测量神经元的活动。即时观测神经元活性的有通过GFP亮度反应钙离子浓度从而间接衡量神经元活性的GCaMP技术和以Arclight 为代表的一类voltage sensor。延时观测神经元活性的则有CaLexA和TRIC技术。这两类技术也是通过Ca2+浓度衡量神经元活性，但和GCaMP的区别在于，Ca2+浓度增高后需要通过驱动下游GFP蛋白表达而产生荧光信号，故而需要给果蝇一个蛋白表达的时间窗口。除了单个神经元的活动，神经元之间的上下游关系也是环路研究的关键。针对这个问题，目前最广泛使用的技术是活性依赖的GRASP技术，在明确上下游神经元的前提下，若神经元间存在突触连接则形成完整的GFP蛋白；trans-Tango 和TRACT技术则是对于明确的神经元，通过突触之间的传递使下游神经元表达特定的荧光蛋白从而观测到下游神经元。
loss-of-function和 gain-of-function 在神经环路研究中的体现则是使神经元失活和激活。物理性失活是使用高强度laser切断神经元。基因层面的操作是通过驱动Tetanus toxin, Kir2.1,Shibire,和reaper的表达实现。Tetanus toxin 的功能在于阻止突触囊泡形成，shibire 则是阻止突触囊泡的回收，kir2.1则是一类使钾离子内流的通道，通过钾离子内流使神经元去极化，从而难以引发动作电位。Reaper 是会使得细胞凋亡。激活神经元有光遗传和表达TrpA1蛋白的方法。除此以外，还简单介绍了一些自动化分析行为的程序，自动化进行果蝇行为实验的装置，以及Janelia 一个分析了果蝇不同脑区功能的数据库。
希望本次的分享能够对大家有所帮助！
By 孙梦实
（本次journal club的slides见附件）